天然产物，这些在自然界中经过长时间自然选择而保留下来的次生代谢物，因其独特的药用价值而在多个领域得到广泛应用。然而，随着现代科学技术的飞速发展，人们对天然产物高纯度产品的需求也日益增长。传统的分离纯化方法，如溶剂萃取、色谱分离等，面临着有机溶剂消耗大、分离效果不理想、成本高昂以及周期长等挑战，这些不足严重限制了天然产物在各领域中的进一步应用。幸运的是，新型分离纯化技术的出现为天然产物的提取、分离和应用带来了新的突破。本文旨在全面综述这些新型分离纯化方法，并探讨天然产物分离纯化的研究瓶颈与未来发展方向。

0 引言

天然产物，这些在自然界中历经漫长岁月自然选择的次生代谢物，因其独特的药用价值而备受瞩目。它们广泛存在于植物、陆地动物、昆虫、海洋生物以及微生物等天然基质中，不仅维持着生物体的组织器官完整性及正常生长发育，更拥有多种生物活性和医学价值。事实上，已有众多研究证实，天然产物在抗癌、抗病毒、治疗白血病、预防神经退行性疾病、抗氧化以及降血糖等方面展现出卓越的药理作用。

根据生物合成来源，天然产物及其衍生物可分为植物、动物、微生物和矿物四大类。其多样性源于水生和陆生物种的庞大生物多样性，它们合成了结构各异的分子，赋予了这些天然产物广泛的生物活性。特别值得一提的是，植物来源的药用天然产物，如次级代谢产物，它们虽对植物的基本生命活动并非不可或缺，却对植物的环境适应及抵御外界压力起到了关键作用。

正因许多天然产物具有显著的药用价值，它们成为了临床上众多药物的直接或间接来源，诸如吗啡、奎宁、青蒿素、紫杉醇以及青霉素等。尽管药物研发面临高成本、高耗时及高风险等挑战，但天然产物在药物开发方面所展现出的独特优势仍不容忽视。其通过自然界长期进化而产生的特定结构与活性，往往超出人们的想象。因此，尽管合成药物的比例在逐渐增加，但天然产物依旧是药物或先导化合物的重要来源。
随着科学技术的飞速发展，化学、生物学及医学等多个学科领域的交叉融合，为天然产物药物的开发带来了前所未有的机遇。然而，天然产物的分离、测定、活性筛选以及毒性评价等环节，仍面临着诸多挑战。其中，提取和分离纯化无疑是关键的第一步。在植物界，存在着数量庞大的代谢物，包括初级代谢物和次级代谢物，这使得获取高价值化学品的过程变得异常复杂。因此，探究新型的天然产物分离纯化技术显得尤为重要。

传统方法如分级沉淀、凝胶色谱等，在面对复杂的天然产物基质时，往往显得力不从心。它们不仅分离效率低下，成本高昂，还可能造成环境污染，延长制备周期。针对这些问题，众多科研团队正在努力开发新型分离纯化技术，并对传统方法进行优化。目前，已经取得了一些令人瞩目的成果，例如逆流色谱、亲水相互作用色谱以及分子印迹技术等。

本综述旨在概述这些新型分离纯化方法，并详细探讨它们的原理、应用范围、优缺点等。同时，我们也对当前面临的难题和未来的发展方向进行了深入的思考和展望。

新型色谱方法

色谱法一直是天然产物分离分析的核心技术。根据其工作原理，色谱法可分为正相色谱、逆流色谱、反相色谱、多维色谱以及超临界流体色谱等。尽管传统色谱方法在分离效果上表现优异，但它们往往消耗大量溶剂、样品进样量受限且分离效率有待提升。因此，近年来科研人员不断探索新的天然产物分离色谱技术。

1 逆流色谱

逆流色谱法（CCC）是一种高效的制备分离技术。其原理基于样品在两种互不混溶的溶剂中的分配作用。由于溶质中各组分在两溶剂中的分配系数存在差异，因此可以利用液-液分布原理对混合物进行高效分离。逆流色谱法能够在无需使用固相载体的条件下，通过连续分布在不相溶的液-液两相之间的目标化合物，实现连续高效的分离。

传统的天然产物分离方法通常涉及多个液液萃取步骤，再结合不同的色谱方法对单体化合物进行分离纯化，这些方法不仅耗时长、溶剂用量大，还存在样品变性和不可逆吸附的风险。而高速逆流色谱（HSCCC）则克服了这些传统柱色谱分离的弊端，具有洗脱方法灵活、上样量大、产品纯度高以及操作简便等显著优点。因此，高速逆流色谱已广泛应用于天然植物中生物活性化合物的分离和纯化，如蛋白质、多糖、多酚等的制备。

尽管逆流色谱法具有诸多优势，但其操作过程中的色谱条件优化对分离结果的影响不容忽视。Yang等研究者通过建立新的线性梯度洗脱方法，制备了包含不同比例庚烷、乙酸乙酯、甲醇和水的双相溶剂系统，并成功应用于优化甲醇等压和线性梯度的逆流色谱分离条件。最终确定了最优系统为3:7:4:6（v/v/v/v），在此条件下，12种木樨草根中极性范围广泛的复杂混合物得到了高效分离。
还有研究探索了将萃取与逆流色谱结合的方法，旨在降低溶剂消耗。Song等研究者提出了一种新方法，通过逆流色谱直接连续进样来富集植物提取物。他们将正己烷-乙腈-水溶剂系统泵入CCC柱，并直接连续进样含有45%乙腈的提取液。由于萃取液作为流动相，该方法显著减少了溶剂的使用。实验中，他们进样了39g款冬粗提物，经过5小时的单次运行，成功获得了8g的倍半萜烯类富集物，并进一步纯化出3种主要的倍半萜烯类化合物。值得注意的是，逆流色谱法在回收率方面表现出色，三种化合物的平均回收率分别达到1%、9%和6%，明显高于传统柱色谱的平均回收率。

尽管逆流色谱在天然产物分离方面显示出诸多优势，如高样本负载力、高回收率等，但其在实际应用中仍面临一些挑战。例如，在溶剂体系的选择和优化上，目前尚缺乏充分的理论依据。此外，其分离原理、流体动力学平衡、以及分离理论等问题也需要进一步深入研究。同时，逆流色谱的分离效果容易受到两相密度差、温度、体积流量、转速等多种因素的影响，这增加了操作的复杂性和不确定性。另外，溶剂消耗过多和分离时间长等问题也限制了逆流色谱的广泛应用。因此，需要不断改进和完善逆流色谱技术，以充分发挥其在天然产物分离领域的潜力。
亲水相互作用液相色谱（HILIC）是一种独特的分离技术，它使用极性固定相和极性有机溶剂的水溶液作为流动相。相较于传统的反相液相色谱，HILIC在分离强极性和亲水性化合物方面展现出了卓越的能力。其分离机制相当复杂，但目前被广泛接受的是Alpert提出的分布机制：在流动相进入色谱柱后，固定相表面会选择性吸附水分子，从而在表面形成一层动态的“富水层”。溶质在这层富水层与大块流动相之间进行分配，同时，多种作用力如吸附、氢键、偶极-偶极相互作用、静电相互作用、分子形状选择性以及分析物与固定相之间的疏水相互作用等也可能共同影响分离过程。这一复杂机制的形象描绘如图1所示。
图1（a）展示了HILIC保留机制中的亲水-减水模型，该模型描述了溶质在色谱柱中的分配行为。图1（b）则通过蜘蛛图清晰地展现了22个具有代表性的HILIC色谱柱的选择性。
在HILIC中，固定相扮演着至关重要的角色。过去二十年来，科学家们已经探索并引入了众多HILIC固定相，其中最常用的包括无键硅胶、酰胺、二醇以及中性离子等。此外，还有许多新兴的固定相如金属有机骨架（MOF）、共价有机骨架（COF）、石墨烯以及磁性元素等被不断开发出来。特别是MOF，它凭借出色的化学稳定性、高机械强度、大比表面积和丰富的官能团密度等优势，在HILIC领域展现出了巨大的潜力。

尽管HILIC在分离极性成分方面表现出色，但仍面临一些挑战。例如，其分离原理涉及多种复杂的相互作用，这使得峰形异常的问题时有发生。因此，对流速、柱温、固定相键合基团、pH值、缓冲盐类型等参数的精细优化变得至关重要。同时，HILIC柱的平衡时间也是一个需要关注的因素，因为它直接影响到分离的重复性和准确性。

面对这些挑战，HILIC技术的未来发展将聚焦于深入研究其分离机理以及不断研发新型固定相。这些努力旨在进一步提高HILIC的分离性能和稳定性，从而更好地满足复杂样品分析的需求。
超临界流体（Supercritical fluid，SF）在近十年内已逐渐成为传统分离方法的革新替代。其广泛应用在生物分析、食品安全及环境监测等多个领域，显示出显著的优势。由于传统天然产物分离方法常需大量有机溶剂，对环境造成严重污染，因此寻求绿色溶剂替代传统挥发性有机溶剂显得尤为重要。在此背景下，超临界流体中的离子液体和深共晶溶剂作为新兴绿色溶剂受到了广泛关注。

离子液体，由阴离子和阳离子通过离子键结合而成的低温熔盐，在室温或近室温下呈液态，被誉为“液体分子筛”。其优异的物理化学性质，如宽液体范围、低蒸气压、不挥发、高电导率、良好溶解性和广泛适用性，使其成为理想的分离提纯溶剂。液-液萃取是离子液体分离的一种常用方法。例如，Chen等通过合成离子液体接枝的二氧化硅材料（IL@SiO2），实现对青蒿素中青蒿烯的有效吸附分离。这种创新方法为离子液体在天然产物分离中的应用提供了新的思路。
由于青蒿素与青蒿烯结构相似，仅有一个双键的差异，使得传统的柱层析方法难以实现它们的完全分离。同时，离子液体基液-液萃取法也面临挑战，因为离子间存在的强静电和氢键相互作用导致离子液体黏度升高，进而影响系统传质，降低分离效率。针对这些问题，研究者们提出了一种创新的解决方案：将具有官能团的离子液体接枝到固体材料上。这种策略不仅增强了离子液体与青蒿烯之间的n-n共轭相互作用，提高了对青蒿烯的亲和力，从而成功克服了传统柱层析方法的局限。更重要的是，该方法避免了大量有机溶剂的使用，使得纯化后的青蒿素纯度高达97%，且在连续循环使用6次后仍能保持一定的纯化效果。

图2展示了IL@SiO2分离青蒿烯的原理。而温度响应型离子液体（TRIL）则是一种能够在环境温度变化时改变自身状态（如亲水性或亲脂性）的离子液体。这种特性使其在分离不同极性化合物方面展现出巨大潜力。Luo等研究人员开发了一种可切换温度响应的离子液体基微乳液。他们以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1,2-丙二醇和水为原料，制备了这种TRIL。随后，他们将该TRIL作为油相引入微乳液中，从而形成了一种具有温度响应的新型无表面活性剂微乳液，即TRIL-SFME。这种微乳液无需额外添加化学破乳剂即可实现破乳，与传统ILs分离方法相比，其提取率提高了50至79倍。此外，亲水性化合物（如酚酸）和亲脂性化合物（如生物碱）在3分钟内即可实现原位分离富集。这一创新策略不仅克服了TRIL作为溶剂在萃取过程中传质速率慢、萃取效率低的问题，还具有高效绿色、能够同时从植物基质中提取、原位分离和富集不同极性天然活性化合物的特点。为了进一步了解萃取过程，他们还采用了DPD方法进行模拟，展示了TRIL-SFME和6个目标化合物的组分随时间变化的示意图。

图3展示了TRIL-SFME对目标化合物提取过程的DPD模拟，包括初始态和平衡态。尽管离子液体（ILs）在天然产物分离方面展现出巨大潜力，但仍面临诸多挑战。例如，尽管ILs的研究应用日益深入，但其作用机理的基础研究尚显不足，且缺乏对不同阴阳离子组成导致ILs性质变化规律的全面总结。此外，尽管ILs与传统有机溶剂相比蒸气压更低、不易挥发，但其生物毒性问题仍需关注。同时，ILs的结构和制备工艺的复杂性也导致其生产成本相对较高，回收和循环利用成为其应用的一大难题。

另一方面，深共晶溶剂（DES）作为一种新兴的分离技术，也备受关注。DES是由Abbott等于2003年发现的一种共晶混合物，其基本形式为Cat+X-zY，其中Cat+可以是铵、磺酸或磷，X-是Lewis碱，Y是Lewis酸或Brønsted酸。根据氢键供体和氢键受体的不同，DES可分为几种主要类型。与ILs相比，DES的合成原料包含碳水化合物、氨基酸和多元醇等，其分子间相互作用主要通过分子间作用力实现，而非共价键或离子键。这种差异使得DES在适用范围上与ILs有所不同，为天然产物分离提供了新的选择。然而，DES技术的成熟度和应用范围尚需进一步研究和发展。
1,8-桉树脑，这一广泛存在于植物芳香油中的化合物，因其多种生理活性而备受关注。然而，由于1,8-桉树脑常与植物精油中的单萜化合物混合，且沸点相近，通过蒸馏分离变得颇为困难。针对此问题，Liu等人巧妙地利用一系列基于乳酸（LA）的深共晶溶剂（LaDESs），特别是与酪氨酸（Tyr）合成的新型LaDESs，成功实现了1,8-桉叶脑与单萜烯烃的液液分离。值得一提的是，最终产品中1,8-桉树脑的纯度高达99%，充分展现了该方法的低能耗、高选择性和安全性。

在深入探究LaDESs与1,8-桉叶脑的相互作用时，研究者发现，当LA/Tyr/1,8-桉叶脑的比例为1∶1∶1时，LA的羧基氢与1,8-桉树脑的氧之间存在强吸引力。同时，Tyr-LA的N—H…O和O—H…O键长分别为08 Å和92 Å，而1,8-桉叶脑-LA的O—H…O长度为59 Å，这些键长均符合氢键的标准。相较于纯LA，LaDESs与1,8-桉叶脑之间的氢键更短，表明键能有所增加，这在一定程度上解释了LaDESs在提取性能上的优越性。此外，由于Tyr与1,8-桉叶脑之间不存在竞争关系，Tyr的加入反而增强了两者之间的相互作用。

尽管离子液体和深共晶溶剂在天然产物分离方面展现出诸多优势，但它们的应用仍面临一些挑战。例如，DES的高黏度和弱挥发性限制了其在某些分离过程中的应用；同时，DES在自然界中的降解性、对天然产物生物活性的影响等问题尚未得到深入研究。因此，未来仍需进一步探索离子液体和深共晶溶剂在天然产物分离中的应用潜力及其对环境和生物的影响。
在无机盐或聚合物的存在下，离子液体或深共晶溶剂可以形成水两相体系，即ATPS。这一体系为天然产物的分离提供了一种新思路。然而，由于水分子具有强大的氢键形成能力，DESs在水中并不稳定，这需要在构建ATPS时严格控制水的浓度。另一方面，对于含无机盐的ATPS，盐析作用成为影响相分离和萃取的关键因素。当加入的盐中含有共向离子时，由于共向离子的极化作用，其周围的H2O分子会以更规律的顺序排列，从而降低自由能。

Wang等人最近开发了一种新型的绿色溶剂热切换体系——深共晶溶剂/离子液体/水混合物（DIWM）。这种体系是基于他们之前报道的温度响应提取系统演变而来，能够在65℃下同时提取亲水和疏水化合物。与传统的热切换体系相比，DIWM具有更低的相变温度（60℃），并且在室温下即可实现原位分离。该体系由ChCl:LA/[BMIM]PF6/H2O以一定比例混合而成，成功应用于迷迭香叶片中迷迭香酸和鼠头草酸的提取与分离。在最佳条件下，目标化合物在60℃下冷却至25℃时，萃取液从单相系统转变为两相系统，其中迷迭香酸主要分布在上相，回收率高达97%，而鼠头草酸则主要分布在下相，回收率达到46%。这一方法具有提取条件温和、能耗低、操作简便以及提取效率高等显著优点，在天然产物的综合提取方面展现出广阔的应用前景。
分子印迹技术（Molecular imprinting technology, MIT）是一种模拟酶与底物、抗体与抗原相互识别的技术，它能够促进对模板分子的特异性识别。分子印迹聚合物（MIPs）作为一种人工合成的结合剂，能够通过靶向结合位点捕获特定模板分子。其制备过程包括功能单体与交联单体在模板分子存在下的共聚，以及后续的模板分子洗脱，从而在聚合物材料上形成与模板分子匹配的三维孔洞。MIT因其高选择性、稳定性、实用性及低成本等优势，在天然产物分离领域受到广泛关注。

1 磁性分子印迹聚合物
磁性分子印迹聚合物（MMIPs）结合了磁性纳米颗粒的优异性能和分子印迹技术的特异性识别能力。其制备方法是在磁性纳米颗粒核上涂覆功能单体和交联单体，形成具有众多识别位点的聚合物材料。通过外部磁性装置，可以迅速将MMIPs从样品中分离，无需过滤或离心步骤，简化了分离过程。MMIPs在色谱分离、细胞识别、靶向给药、传感器和食品分析等多个领域展现出广阔的应用前景。

然而，传统分离提取方法常在有机溶剂中进行，高极性溶剂如甲醇、乙醇、沸水和碱性水等的使用会对MIP的识别能力产生影响。为了在高极性溶剂中有效使用MIP，Zhang等人提出将胶束与MIP相结合，以提供更大的疏水环境。这种改进方法有望增强MIP在高极性溶剂中的识别能力，进一步拓展其应用范围。
磁性纳米颗粒作为载体，我们成功制备了结构稳固、化学性能卓越的磁性胶束纳米颗粒（MMNP）。利用这些颗粒，我们在强极性溶剂中成功分离了芦丁。具体来说，4-乙烯基-吡啶（4-VP）通过氢键与模板分子芦丁紧密结合，而硼酸则在碱性溶液中与含顺式二醇的芦丁形成环硼酸盐化合物。这种化合物在酸性条件下能迅速断裂酯键，从而实现分子的可逆识别。接下来，我们合成了模板功能单体，并通过疏水相互作用将其掺入胶束中。随后，利用紫外光将功能单体的双键与交联剂交联，从而将功能单体固定在胶束上，形成带正电的MIP。通过静电吸附，我们将MMIP牢固地吸附在改性的磁性纳米表面上，进而形成核-壳MMNIP微球。在经过优化的洗脱条件下，MMNIP能够从药材粗提物中高效地分离出芦丁，吸附量高达58 mg/g。
与传统的分离方法相比，磁性胶束分子印迹技术具有显著的优势。其疏水/亲水性核/壳结构不仅增强了在强极性溶剂中的稳定性，还提供了更大的比表面积，使得印迹空穴更易于模板的吸附和洗脱。此外，MMIPs的高选择性和超顺磁性使其在多种天然产物分离领域都表现出色。

尽管如此，MMIPs仍面临一些挑战，如功能单体种类的限制、精度和再生性的提升、以及制备成功率的提高等。未来，我们计划通过筛选和合成新的配体、接枝亲水基团等方法，进一步优化MMIPs在亲水性聚合反应中的适用性。同时，利用多元功能单体制备具有多识别位点的MMIPs，将有望拓宽其应用范围并提高印迹精度。此外，对制备流程的优化和工艺的简化也是我们努力的方向，旨在解决磁响应性能下降和颗粒团聚等问题。
固相萃取（Solid-phase extraction，SPE）是液固基质样品制备中的一项关键技术。它能够高效地从流体介质中分离、浓缩和纯化目标分析物，且操作简便、回收率出色、适合自动化处理，同时还能显著减少溶剂的使用。在SPE过程中，吸附剂的选择至关重要，因此，新型SPE吸附剂的开发一直是研究热点。分子印迹聚合物（MIPs）因其对特定结构的高选择性、低成本、高稳定性以及出色的重复使用性，已成为SPE的理想选择。一个典型的分子印迹固相萃取装置由熔块和MIP组成（如图4所示），它展示了分子印迹固相萃取的完整流程。

分子印迹固相萃取（MISPE）程序
绿原酸（CGA）是杜仲中一种高效的酚类抗氧化剂和防腐剂，由咖啡酸和奎宁酸合成，具有延长食品保质期的功效。然而，从深共晶溶剂中提取绿原酸面临挑战，因为深共晶溶剂具有低蒸气压和强混溶性。传统吸附剂存在预处理复杂、吸附和洗脱时间长等问题。为此，研究者们尝试使用分子印迹聚合物（MIPs）来改善选择性并提高回收率。

Liu等以绿原酸为模板分子，通过本体聚合形成了MIP。他们利用计算模拟研究了甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AM）和2-乙烯基吡啶（2-VP）三种功能单体与绿原酸的相互作用。结果显示，MAA与绿原酸的复合体系具有最大的结合能（-248 kJ/mol），主要依靠绿原酸中的羟基氧原子和羰基氧原子与MAA形成氢键。此外，模拟还揭示了具有高结合能的CGA-MAA在印迹过程中能产生更多特异性识别位点，从而提高了MIPs的吸附量（170 mg/g）和选择性（IF=72）。这一发现为从杜仲叶深共晶溶剂萃取物中高效提取绿原酸提供了新思路。

尽管分子印迹固相萃取具有诸多优点，如操作简便、特异识别性强等，但它主要适用于刚性小分子，对生物大分子的处理能力有限。此外，洗脱过程可能对目标分子的构象造成不可逆损伤，导致产物损失；同时，洗脱剂通常为有机溶剂，限制了其在水等强极性溶剂中的应用。因此，寻找一种适用于水等强极性溶剂的新型功能单体是该技术面临的重要挑战。此外，降低成本、实现大规模工业化生产也是该技术需要解决的问题。
功能单体和交联剂是制备分子印迹聚合物（MIPs）过程中的关键因素，它们不仅影响印迹位点的形成，还决定MIPs对生物活性物质的识别特异性和灵敏度。然而，传统的功能单体和交联剂往往受到功能性不足和毒性问题的制约。相比之下，深共晶溶剂（DESs）作为新型功能单体和交联剂，展现出优异的环保性能。深共晶溶剂在单独用于混合物分离时，能够同时萃取出与目标物质具有相似极性和理化性质的组分，从而有效改善MIPs的吸附性能。

芥子酸，一种广泛分布于植物中的天然酚酸类化合物，具有显著的抗氧化和抗炎作用。Sun等以油菜花粉为原料，经过高温焙烧去除外部有机物后，制备出一种分层多孔支撑骨架（CRP）。他们进一步将这种CRP与不同种类的氯胆碱基深共晶溶剂结合，作为功能单体和交联剂，成功构建了高效的MIP（CRPD-MIP）。实验结果显示，该MIP对芥子酸的吸附能力高达154 mg/g，同时展现出优异的选择性（IF=24）和快速的动力学吸附平衡（60 min）。CRPD-MIPs在从实际样品中提取芥子酸方面表现出理想的精度和实用性，为生物废弃物资源的再生利用提供了新的可能。

CRPD-MIPs的构建及其在辛酸选择性提取中的应用

结论与展望

天然产物的提取分离对于药物研发至关重要，传统方法虽有效，但存在诸多瓶颈，如提取时间长、溶剂损耗大、选择性差等。为此，我们提出了以下展望：首先，结合新型仪器与物质，如相变、高温、高压等条件，优化传统色谱方法；其次，探索超临界流体与分子印迹技术在天然产物分离中的应用，通过软件模拟调整合成体系，拓展技术谱系；最后，整合多种分离纯化技术，优化天然产物分离方法，提高研发深度。总之，新型天然产物分离纯化技术已广泛应用于多种化合物，改进分离策略对于提高天然产物利用效率、推动新药开发具有重要意义。随着科技发展，天然产物的分离纯化将迎来更高层次的发展。